Imágenes de citometría unicelular

Citometría de flujo

La citometría de flujo es un método bien establecido que los biólogos e ingenieros biomédicos suelen utilizar para caracterizar células individuales que están suspendidas en solución. En la citometría de flujo convencional, estas células pasan a través de un microcanal y se sondean con un láser. La interacción láser-célula causa dispersión de fotones (para obtener granularidad y tamaño) y / o emisión de fotoabsorción y fluorescencia (para detectar marcadores moleculares en las células). Finalmente, el software de procesamiento de datos toma las señales de dispersión y fluorescencia y las combina de manera que se puedan obtener estadísticas importantes de la población determinada de células. Esta técnica incluso se ha extendido a la clasificación de células, donde una mezcla heterogénea de células se puede clasificar rápidamente en función de la dispersión individual y la señal de fluorescencia de cada célula.
(Figura 1: Ilustración de citometría de flujo. Imagen de Wiki. )

Citometría de imagen

La citometría de imágenes es similar a la citometría de flujo, pero en la que se adquieren imágenes de las células a medida que fluyen a través de un microcanal. Esto se hace con dos modos de imagen principales: imágenes de campo brillante y fluorescencia. A partir de una imagen de campo claro, se pueden discernir las características físicas de las células: tamaño, forma, opacidad, granularidad, elasticidad, etc. Por otro lado, se utiliza una imagen de fluorescencia para identificar tanto el tipo como la distribución de los biomarcadores clave presentes en cada célula. ( Figura 2: Ilustración de datos prototípicos de citometría de imágenes. Imagen de GEN

Citometría de imagen de alta velocidad

La captura de datos de citometría de imágenes a velocidades extremadamente altas genera nuevos desafíos físicos. En primer lugar, las células que se mueven rápidamente dentro del microcanal exigen sensores capaces de tiempos de exposición ultracortos (del orden de microsegundos). Esto es necesario para eliminar el desenfoque de la imagen, un artefacto de imagen que se produce cuando un objeto se mueve mucho durante la captura de la imagen (o durante los tiempos de exposición). Desafortunadamente, tener tiempos de exposición cortos conlleva otro desafío de imágenes. Los tiempos de exposición cortos limitan la capacidad de recolectar suficiente luz para generar imágenes de alta calidad de eventos con poca luz (es decir, fluorescencia). Normalmente, para las células etiquetadas, la señal emitida es relativamente baja para los tiempos de exposición de la cámara en milisegundos. Además, cuando se excitan, las células etiquetadas emiten isotópicamente y, por lo tanto, el número de fotones disponibles para la formación de imágenes disminuye por la ley del cuadrado inverso. Estos hechos hacen que sea específicamente difícil, o en algunos casos incluso imposible, para las aplicaciones de imágenes de fluorescencia que exigen velocidades de cuadro del orden de uno a dos mil cuadros por segundo y más. Actualmente, la estrategia para lograr velocidades más altas es acoplar la cámara con un intensificador de imágenes. Además, también hay sensores sCMOS intensificados comerciales (es decir, de PCO) capaces de 100 a 7000 cuadros / sa resolución completa y reducida, respectivamente. Una de las características clave de estos sistemas es el bajo ruido de lectura electrónica de 1,1.

Cuando las imágenes de fluorescencia son un desafío a altas velocidades de cuadro y tiempos de exposición bajos, las imágenes de campo brillante están limitadas por las velocidades del sensor CMOS. Esto se debe al hecho de que la retroiluminación proporciona suficiente luz para una buena iluminación incluso con tiempos de exposición de menos de microsegundos, y las velocidades de fotogramas pueden superar el millón de fotogramas por segundo.

Visión artificial aplicada a la biomedicina

El 90% de todos los datos médicos ahora se basan en imágenes. Una mayor necesidad de automatización y una creciente demanda de sistemas basados en la visión están impulsando la adopción a gran escala dentro de la comunidad de atención médica.

La citometría de imágenes, la obtención de imágenes unicelulares de alta velocidad, está demostrando ser eficaz para el análisis unicelular a gran escala debido a su capacidad para mejorar la precisión de la identificación fenotípica al tiempo que conserva las características nativas de la muestra celular.

Una vez que las células se identifican y segregan, se puede recopilar un número considerable de métricas cuantitativas para crear perfiles morfológicos únicos. Las similitudes entre los perfiles pueden correlacionarse para definir nuevas subpoblaciones o identificar fenotipos específicos de determinadas enfermedades. Este tipo de automatización puede acortar el tiempo entre la muestra y el diagnóstico.

Tomemos como ejemplo la sepsis, una infección que es la principal causa de muerte en los hospitales de EE. UU. El ochenta por ciento de las muertes relacionadas con la sepsis podrían prevenirse mediante un diagnóstico y tratamiento más rápidos. Los médicos de la sala de emergencias emplean una serie de pruebas de laboratorio, radiografías, tomografías computarizadas o resonancias magnéticas para identificar la ubicación de la infección, pero un análisis preciso requiere tiempo.

Mediante la citometría de imágenes, los investigadores pueden reducir el tiempo hasta el diagnóstico midiendo los cambios en las propiedades biomecánicas de las células inmunitarias. Uso de la deformabilidad de los granulocitos como biomarcador fenotípico diferenciador entre muestras de sangre de pacientes con sepsis y donantes sanos. Las características correlacionadas llevaron a la creación de un "perfil de expresión" que podrían compararse con nuevas muestras de pacientes y generar los resultados de las pruebas & nbsp; en menos de diez minutos.

La cámara fantasma lidera el camino

Vision Research ha diseñado cámaras de visión artificial para satisfacer las necesidades de los ingenieros de citometría de imágenes. Para que la citometría de imagen logre resultados óptimos, se requieren cámaras de alta velocidad con píxeles más grandes, generalmente entre 10 y 30 micrones de borde. En un experimento de citometría típico, las velocidades de cuadro de hasta 10,000 cuadros por segundo son comunes. Además, una mejor calidad de imagen (profundidades de bits seleccionables de 8, 10 y 12) junto con una mayor sensibilidad a la luz conduce a la captura de datos de imagen de calidad significativamente mayor. En particular, las cámaras de visión artificial Phantom son las cámaras de visión artificial más rápidas del mundo, capaces de transmitir más de 9 gigapíxeles de datos de imagen por segundo a medios que pueden almacenar más de 22 TB y más. Figura 3, & nbsp; muestra datos típicos de citometría de imagen, donde una célula viaja rápidamente a través de un microcanal. & nbsp; La cámara pudo capturar el tamaño, la forma, la velocidad de rotación e incluso resolver algunos de los detalles internos de la celda. Este experimento se realizó con la cámara de visión artificial Phantom S990.

La citometría de imágenes también requiere la identificación automatizada de fenotipos celulares; de lo contrario, la tecnología se vuelve limitada en su alcance de beneficios potenciales. Esta necesidad impulsó el desarrollo de un nuevo software diseñado para trabajar con imágenes de alta velocidad.


En un experimento reciente, Kyle Gilroy, PhD of Vision Research, desarrolló un "modelo" rsquo; sistema que consta de microesferas de poliestireno (diámetro = 25 µm) que fluyen a través de un canal de microfluidos a altas velocidades. Se usó una Cámara de visión artificial Phantom S640 para monitorear el movimiento rápido de las microesferas mientras atravesaban el canal. (velocidades de la cámara a 3300 fotogramas por segundo). Luego, el software desarrollado por Marco Gajardo y Mikael Brommels de Spicatek se utilizó para analizar rápidamente estos datos para la extracción de datos fenotípicos clave. Se puede ver un ejemplo de datos típicos en la Figura 4 . Lo más notable es que el análisis de la imagen se pudo realizar y los datos resultantes se informaron al usuario antes de que se capturara el siguiente cuadro.